Начало

Какво живее в българското кисело мляко

     С метагеномно секвениране се установява присъствието на ДНК от общо 108 бактериални вида.

     Киселото мляко е най-известната в света българска храна. Получава се от прясно мляко вследствие на протичане на млечнокисела ферментация. Предполага се, че умението за получаване на ферментирали млечни продукти е възникнало случайно през древността, възможно е паралелно на повече от едно място. Заслуга на нашите предшественици е, че са съхранили през вековете тази традиция. Киселото мляко е популяризирано в началото на 20 век чрез научните разработки на откривателя на Lactobacillus bulgaricus д-р Стамен Григоров и носителя на Нобелова награда Иля Мечников. По света е известно основно под названието йогурт. В България киселото мляко се причислява към основните храни и до днес значителна част от населението консумира продукта почти всеки ден.

Пробиотици

     Бактериите, които правят киселото мляко, на практика са първите известни пробиотици. Съгласно официалната дефиниция пробиотиците са „живи микроорганизми, които, когато се прилагат в адекватни количества, предоставят ползи за здравето на гостоприемника.“ Най-често пробиотичните бактерии се развиват в мляко, използват неговите хранителни компоненти, и в резултат на това променят свойствата на изходната суровина. В киселото ни мляко пробиотичните бактерии са живеещите в симбиоза Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus и Streptococcus thermophilus. Тези два микроорганизма са и единствените включени в приетата в света дефиниция за йогурт, която въпреки многобройните „иновации“ и включване на допълнителни микроорганизми в сходни продукти остава непроменена. Често пробиотичните млечнокисели бактерии на първо място удължават трайността на млечните храни и това им свойството е запазило ферментиралите продукти през вековете. През 20 век научните изследвания показват, че в допълнение те притежават редица полезни за консуматорите качества:

• потискат развитието на патогенни бактерии във ферментиралите храни;
• регулират непоносимостта към лактоза при хората;
• помагат при лечението на гастроентерити;
• спомагат за преодоляване на предизвиканите от антибиотици хранителни разстройства;
• подобряват лечението на тумори на дебелото черво, както и редица възпалителни състояния на червата;
• понижават серумния холестерол;
• подпомагат имунитета и устойчивостта към алергии и инфекции.

Да направим кисело мляко

     Много от нас имат практика, но нека тук отново опишем рецептата. Купуваме качествено прясно мляко. Много често това от магазина се оказва неподходящо, затова млякото на бабите от пазара е на почит. Първо и задължително, млякото се сварява/пастьоризира, за да убием всички бактерии и животински клетки в него, които могат да бъдат източник на зарази и причина за разваляне. Когато млякото изстине до около 40-45 градуса в 500 мл се добавя приблизително една супена лъжица от предишното кисело мляко, след това буркана се оставя на топло място, например увит в дебела хавлия, за една нощ, а на сутринта се прехвърля в хладилника.

     В промишлени условия този процес е по-сложен, но принципно аналогичен. Използва се стандартизирано и пастьоризирано мляко и индустриална закваска съдържаща симбиотична бактериална култура. Много важно е суровината да не е замърсена с остатъци от антибиотици, за което има съответните тестове, и да не е прекалено разредена с вода. Температурното третиране на около 40-45 градуса продължава няколко часа и се следи киселинността на продукта. Процесът на производство и изискванията за качество и безопасност са описани в БДС 12 2010. Основното изискване за готовия продукт е до края на неговия срок на годност в него да се запазва огромно количество живи пробиотични бактерии: 100 000 000 мл Streptococcus thermophilus и 10 000 000 мл Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus.

Какво не знае потребителят

     Съгласно теорията в 1 мл или грам кисело мляко се съдържат над 100 милиона живи пробиотични бактерии. Те потискат развитието на всички други, включително патогенните, микроорганизми и затова йогурта има дълга трайност и е безопасен за консумация, разбира се при правилно съхранение. Всяка теория обаче има лимити и ограничения. Ето няколко от тях:

• споменахме, че преди добавяне на закваската за ферментация, млякото задължително се пастьоризира, което убива микроорганизмите. Това обаче не е вярно на 100%. Някои бактерии оцеляват, най-често спорообразуващи;
• хигиената е ключово изискване при производството на кисело мляко. Много често нарушения в технологията водят до вторично замърсяване на пастьоризираното мляко, например от опаковки, оборудване, персонал и др.;
• понякога производителите хитруват и добавят допълнителни съставки. Най-често това са сгъстители и с тях в млякото се вкарват и странични микроорганизми, някои от които са способни да се намножат.
• от голямо значение е качеството/микробиалната чистота на използваната закваска.

     Когато киселото мляко се произвежда в домашни условия замърсяванията с други микроорганизми, включително дрожди и плесени, е често. Това може да доведе до намаляване на трайността, но също така и до откриване на нови млечнокисели бактерии. Познаването на тази странична микрофлора дава ценни насоки за контрол на микробиологичното качество на продукта при индустриалното производство на кисело мляко. Навлизащият метод на метагеномния анализ е инструмент, даващ възможност за изучаване на сложни микробиални съобщества в по-голяма дълбочина.

      Целта на това изследване е да се идентифицират всички бактериални видове в четири търговски марки кисело мляко посредством 16s метагеномно профилиране.

     Проучването е спонсорирано от Асоциация „Активни потребители“ и реализирано от Център по Биология на Храните, Биологически Факултет на Софийски университет, холандска компания за секвениране и водещи научни експерти от млекопреработвателната индустрия. Изследването е част от проект за подобряване на качеството и безопасността на млечните продукти.

Метагеномен анализ

     При традиционното идентифициране на бактерии пробите, в случая кисело мляко, се култивират върху специфични хранителни среди. Порасналите бактерии се изолират и анализират с различни методи, например биохимични тестове за видово определяне. Този класически метод обаче не може да обхване всички присъстващи бактериални видове.

     При метагеномния анализ се използва друг подход. Изолират се не бактериите, а техните нуклеинови киселини, т.е. ДНК. Понеже тя е в много ниска концентрация, се намножава посредством PCR реакция. Търсят се специфични участъци/гени на ДНК. Всяка бактерия има своя уникален ДНК подпис. Обикновено за идентификация на бактериите се използва 16s рРНК ген. Краткият алгоритъм е следния:

• Изолиране на геномна ДНК посредством стандартен кит.
• PCR амплификация на бактериалния 16s рРНК ген (регион V3-V4). Количествен анализ на ДНК и качествен контрол.
• Секвениране на ампликона чрез Illumina MiSeq секвенатор. Параметри – 10 до 50 хиляди прочитания при дължина на фрагмента от 300 нд. на проба.
• Биоинформатика – обработване на суровите данни. Идентификация на таксоните чрез сравняване на секвенциите в генетичната банка и изготвяне на доклад за анализа в текстов и графичен вид.

     Изходният резултат от метагеномния анализ е пълен списък на всички видове бактерии живеещи в съответната проба от кисело мляко.

Резултати

     Общо в четирите търговски марки кисело мляко се установи присъствие на ДНК от изненадващо голям брой бактериални видове – 108. Още поне 21 секвенции не са разпознати в базата от данни на геномната банка и има вероятност някои от тях да се окажат нови видове. Има съществено различие между отделните търговски марки. Например в проба 1 са идентифицирани най-малко бактерии, 25 на брой, а в проба 2 те са общо 45 (виж Таблица 1).

ТАБЛИЦА 1: Общи резултати от идентификацията на бактериални видове в 4 проби кисело мляко

     По-голяма част от бактериите са уникални за съответните търговски марки кисело мляко, т.е. не се срещат в другите. Най-многобройни са те в проба 2, където са 33, от общо 45.

     Интересен резултат се получава при анализ на съотношението между количеството на ДНК от различните бактерии в киселите млека. Очаквано, около 99% от всички  микроорганизми имат корени от внесените млечнокисели закваски. Останалите 1% принадлежат на бактерии от друг произход, вероятно не от закваските. Така ако 99% от секвенциите се свързват с присъстващите около 110 милиона на милилитър бактерии от закваската, то на този фон останалата 1% от ДНК би произлизала от над 1 милион други бактерии. Задълбоченото изследване не е предмет на тази публикация но можем да дискутираме някои по-интересни резултати:

• От таблица 2 се вижда че и в четирите проби се открива ДНК от бактерията Streptococcus salivarius. Този вид е близък до S. thermophilus, но има различна екология и най-често е свързан с млекодайните животни и суровото мляко. В рамките на този вид са селектирани и пробиотични щамове;
• Допълнително, в киселите млека се идентифицира ДНК от още до 15 полезни млечнокисели бактерии от родовете Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacterium и др. Всички те са асоциирани с млечната среда и показват, че в млякото може да се съдържа огромно екологично разнообразие, за което подсказват резултатите дори при само 4 анализирани индустриално произведени млека!
• Индикаторният за замърсяване микроорганизъм Escherichia coli се установява в минимално количество само в една проба;
• Обичайното съотношение между съдържащите се в закваската L. delbrueckii ssp. bulgaricus и S. thermophilus е 1:10. От таблица 2 се вижда, че това съотношение е значително нарушено в проби 2 и 4. което може да е индикация за наличие на проблеми при производствения процес.
• Като изключим секвенциите, които съответстват на L. delbrueckii ssp. bulgaricus и S. thermophilus и на третия по честота S. salivarius, остава ДНК от идентифицирани видове от около половин процент, еквивалентен на около половин милион/мл други бактерии (Таблица 2). Тези резултати дават нови насоки за разширяване на контрола върху микробиалното качество на млякото, както и за проследяване на набиращият скорост въпрос с разпространението в храните на гени, отговорни за антибиотична резистентност.

ТАБЛИЦА 2: В таблицата са показани бактериалните видове с относително най-високо присъствие в процентно отношение.

Някои изводи

• Метагеномният анализ на търговски марки кисели млека е първият подобен в света и доведе до идентификацията на 108 бактериални вида;
• Освен внесените със закваските пробиотични микроорганизми се установява наличие на ДНК от още поне 15 асоциирани с млечната среда потенциално полезни бактерии, както и от около 90 други бактериални вида, които са нетипични за хранителни продукти и затова заслужават допълнително внимание. Тези резултати ще бъдат представени и дискутирани във втората част от изследването;
• Метагеномният анализ е изключително подходящ за изследване на бактериалното многообразие на киселите млека. Той обаче има този недостатък, че отчита присъствието на ДНК и от живи, и от мъртви бактерии. На практика резултатите показват цялата история на млякото, от бактериалните видове, с произход животното, тези попаднали  при издояването, през силната редукция на живите бактерии при пастьоризацията, плюс евентуалните замърсявания при млекопреработвателя, до крайния продукт. От голям интерес остава по-пълното идентифициране на допълнителните видове микроорганизми в различните етапи на добиване и преработка на млякото.